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　　細胞培養的步驟及注意事項

　　一、 復蘇

　　1. 把凍存管從液氮中取出來，立即投入37℃水浴鍋中，輕微搖動。液體都融化后(大概1-1.5分鐘)，拿出來噴點酒精放到超凈工作臺里。

　　2. 把上述細胞懸液吸到裝10ml培養基的15ml的離心管中(用培養基把凍存管洗一遍，把粘在壁上的細胞都洗下來)，1000轉離心5分鐘。

　　3. 把上清液倒掉，加1ml培養基把細胞懸浮起來。吸到裝有10ml培養基的10cm培養皿中前后左右輕輕搖動，使培養皿中的細胞均勻分布。

　　4. 標好細胞種類和日期、培養人名字等，放到CO2培養箱中培養，細胞貼壁后換培養基。

　　5. 3天換一次培養基。

　　二、 傳代

　　1. 培養皿中的細胞覆蓋率達到80%-90%時要傳代。

　　2. 把原有培養基吸掉。

　　3. 加適當的胰蛋白酶(能覆蓋細胞就行)，消化1-2分鐘。

　　4. 細胞都變圓后加如入等體積的含血清的培養基終止消化。

　　5. 用移液槍吹打細胞，把細胞都懸浮起來。

　　6. 把細胞吸到15ml的離心管中，1000轉離心5分鐘。

　　7. 倒掉上清液，加1-2ml培養基，把細胞都吹起來。

　　8. 根據細胞種類把細胞傳到幾個培養皿中。一般，癌細胞分5個，正常細胞傳3個。繼續培養。

　　三、 凍存把細胞消化下來并離心(同上)。用配好的凍存液把細胞懸浮起來，分裝到滅菌的凍存管中，靜止幾分鐘，寫明細胞種類，凍存日期。4℃ 30min，-20℃ 30min，-80℃過夜，然后放到液氮灌中保存。 凍存液的配制： 70%的*培養基+20%FBS+10%DMSO. DMSO要慢慢滴加，邊滴邊搖。

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